Sequenzierservice

Preiswert – Zuverlässig - Schnell

Im Rahmen unseres Sequenzierservices bieten wir Ihnen folgende Dienstleistungen:

• Sequenzierung von Plasmid-DNA und PCR-DNA
• Direkte Sequenzierung aus der Bakterienkultur
• Primer Walking und Genome Walking
• DNA-Präparation und Aufreinigung
• Primer Synthese

Als zusätzliche Leistungen sind weiterhin erhältlich:

• Sequenzen in Publikations-Qualität (bis 800 bp)
• Manuelle Editierung der Sequenzdaten
• Zusammensetzung von Sequenzen (sequence assembly)
• Primerdesign

Die DNA-Sequenzierungen werden nach dem BigDye™ Terminator-Prinzip auf modernen automatischen Kapillarsequenzierern der Firma Applied Biosystems durchgeführt.

Sequenzierung von Plasmid-DNA und PCR-DNA

Sie senden uns Ihre gereinigte Plasmid bzw. PCR-DNA in einer der folgenden Formen zu:

• gelöst in bidestilliertem Wasser
• als gefälltes, Vakuum-getrocknetes Pellet.

Und wir liefern:

• Sequenzen bis zu 600 Basen pro Lauf (Plasmid-DNA)
• Sequenzen bis zu 500 Basen (PCR-DNA)
• kostenlose Standard-Sequenzierprimer
• Schnelle Datenübermittlung per e-mail

Es können sowohl Standardprimer als auch Primer Ihrer Wahl verwendet werden. Bitte beachten Sie die Anforderungen an Ihre eingesendeten Proben, um zufriedenstellende Ergebnisse innerhalb kurzer Zeit (normalerweise innerhalb 48 h) zu gewährleisten.

Direkte Sequenzierung aus der Bakterienkultur

Wir sequenzieren Ihre Plasmid-DNA direkt aus Ihrer transformierten E. coli-Kultur und liefern Ihnen auf Wunsch den ausgewählten Klon als Glycerinkultur oder die präparierte Plasmid DNA. Sie sparen Arbeitsaufwand und Kosten für Plasmid-Präparationen.

Unser Angebot beinhaltet:

• Ausplattierung Ihrer transformierten E. coli-Kultur
• Direkte Sequenzierung der Plasmid-DNA aus 5 selektierten Klonen
• Abgleich der Sequenzierdaten gegen eine Referenzsequenz, die Sie uns zur Verfügung stellen
• Auswahl von Klonen, die das gewünschte Insert in der richtigen Orientierung tragen
• Präparation der Plasmid-DNA des ausgewählten Klons oder Versand als Glycerinkultur

Anforderungen an Ihre eingesandten Proben

DNA-Template-Qualität

Die Qualität Ihrer DNA ist entscheidend für den Erfolg der Sequenzierreaktion. Nur bei Zusendung hochreiner DNA können große Leseweiten und exzellente Datenqualität garantiert werden. Das Verhältnis der optischen Dichte (OD) bei 260 und 280 nm OD₂₆₀/OD₂₈₀ sollte zwischen 1.8 und 2.0 betragen.

Plasmid-DNA:

Die effiziente Abtrennung von Proteinen, genomischer DNA, RNA, Salzen, Detergenzien oder Lösungsmitteln ist erforderlich, z.B. mit einem kommerziellen Kit zur Aufreinigung von Plasmid-DNA. Die Plasmid-DNA sollte in der Präparation überwiegend in superhelikalen ccc-Form (covalent closed circular) vorliegen.
Plasmid-DNA bitte gelöst in bidestilliertem Wasser oder Tris-Puffer bzw. als gefälltes, vakuum-getrocknetes Pellet versenden.

PCR-Fragmente:

Die PCR-Reaktion sollte so optimiert sein, dass sie möglichst nur ein spezifisches Produkt liefert. Entstehen bei der PCR-Reaktion auch unspezifische Produkte, so ist das gewünschte spezifische Fragment nach Auftrennung im elektrischen Feld aus dem Gel auszuschneiden und zu eluieren.
Zur Abtrennung überschüssiger Primer, nicht eingebauter dNTP’s etc. sollte generell ein kommerzieller PCR-Purification Kit verwendet werden.

DNA-Template-Konzentration

Folgende DNA-Konzentrationen sind für die Durchführung der Sequenzierungen notwendig:

Bitte geben Sie die Menge bzw. Konzentration der zu sequenzierenden Proben an oder legen Sie ein Gelfoto bei (aufgetragenes Volumen angeben)!

Standardprimer

Die folgenden Standardprimer stellen wir kostenlos für Ihre Sequenzierungen zur Verfügung:

Kundenprimer

Neben den Standardprimern können auch Ihre individuellen Primer für die Sequenzierungen verwendet werden. Diese sollten folgende Anforderungen erfüllen:

• 17 – 25-mer
• Schmelztemperatur Tm = 50 – 60 °C
• HPLC-gereinigt
• ohne Schutzgruppen oder andere Modifikationen (z.B. Fluophore)
• ohne Verunreinigungen und salzfrei ( in bidest Wasser lösen)
• GC-Gehalt von 40 – 50%, am 3'-Ende Guanidin oder Cytosin
• Vermeidung von Sekundärstrukturen (z.B. Loops, self-annealing sites) und unspezifischen Bindungsstellen im Template

Bitte senden Sie uns pro Sequenzierung mindestens 10 µl Ihrer Primer gelöst in bidestilliertem Wasser in einer Konzentration von 10 pmol/µl. Falls Sie uns höher konzentrierte Primerlösungen zusenden möchten, vermerken Sie bitte die entsprechende Konzentration der Lösung auf dem Reaktionsgefäß. Ihren gewünschten Primer können Sie auch bei uns bestellen (klicke hier).

Für das reibungslose und schnelle Bearbeiten Ihrer Proben unter der Verwendung von Kundenprimern sind wir auf die Angabe der Annealingtemperatur angewiesen – bitte unbedingt auf dem Auftragsformular vermerken!

DNA-Präparation und Aufreinigung

Gerne nehmen wir Ihnen die aufwendige Probenvorbereitung ab und präparieren die DNA in Sequenzierqualität. Die Dienstleistungen, die Sie einzeln oder in Kombination bestellen können, umfassen:

• Aufreinigung von PCR-Fragmenten (aus 10 – 100 µl PCR-Ansatz)

• über Membransäulchen
• mittels Elution aus LMP-Agarosegelen
• mittels Elution aus Polyacrylamidgelen

• Klonierung von PCR-Produkten und DNA-Fragmenten

• in die Standard-Klonierungsvektoren pUC 18, pUC 19, pMOS, pBluescript
• in den von Ihnen mitgelieferten Vektor Ihrer Wahl

• Transformation von Plasmid-DNA

• in die E. coli Stämme TG1, XL1blue, Stabl2, DH1, DH5a
• in den von Ihnen mitgelieferten E. coli Stamm Ihrer Wahl

• DNA-Präparationen

• Plasmid-Miniprep-Format aus 0.5 – 2.0 ml Flüssigkultur (bis 25 µg DNA, high copy number)
• Plasmid-Midiprep-Format aus 10 - 25 ml Flüssigkultur (ca. 50 - 80 µg DNA bei high copy number oder 1 - 5 µg bei low copy number Plasmiden)
• Plasmid-Maxiprep-Format aus 100 – 200 ml Flüssigkultur (ca. 300 - 700 µg DNA bei high copy number oder 10 - 40 µg bei low copy number Plasmiden)

Übermittlung der Ergebnisse

Sie erhalten Ihre Sequenzdaten in höchster Qualität per email als Vier-Farben-Chromatogramm im scf-Format, das Sie mit dem Freeware-Programm „Chromas“ öffnen und bearbeiten können (technelysium.com).