Bestimmung von Kontaminationen durch Mykoplasma sp.

Kontaminationen mit Mykoplasmen stellen ein großes und weit verbreitetes Problem beim Arbeiten mit Zellkulturen dar. Wir unterstützen Sie bei der Qualitätssicherung Ihrer Zelllinien. Unseren Nachweis auf Mykoplasma sp. bieten wir Ihnen als:

• Dienstleistungsanalytik
• Assay-Kit zur Durchführung in Ihrem Labor (Vetrieb durch unseren Kooperationspartner Jena Bioscience GmbH)

Mykoplasmen-Problematik

Mykoplasmen stellen in Zelllinien ein großes Problem dar. Sie sind in der Lage, Sterilfilter bis zu einer Porengröße von 0,22μm zu passieren. Zudem sind Mykoplasmen hochinfektiös, so dass alle Zellkulturen eines Brutschrankes und sogar die Stickstoff-Stammkulturen gefährdet sind. Obwohl in Zellkulturüberständen Konzentrationen bis zu 10⁸ Mykoplasmen/ml erreicht werden können, sind meistens keine auffälligen Absonderlichkeiten der befallenen Kulturen zu erkennen. Jedoch verändern Mykoplasmen als chronische Infektion nahezu jeden Stoffwechselparameter der Zellen nachhaltig. Sie beeinflussen deren Wachstum, ihre biochemischen und immunologischen Eigenschaften sowie deren Lebensfähigkeit. Diese veränderten Eigenschaften der befallenen Zellen können zu zweifelhaften, nicht reproduzierbaren Ergebnissen experimenteller Untersuchungen führen.

Qualitätssicherung

Eine unerlässliche Grundvoraussetzung für zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse ist die Arbeit mit mykoplasmenfreien Kulturen. Die beträchtlichen Auswirkungen von Mykoplasmenkontaminationen auf die Aussagekraft experimenteller Untersuchungen werden häufig unterschätzt. Der Anspruch auf hohe Qualität und das Verantwortungsbewusstsein des jeweiligen Laborleiters machen beim Umgang mit Zell- und Viruskulturen eine regelmäßige Kontrolle auf Mykoplasmenkontaminationen unerlässlich. Nur die regelmäßige Kontrolle kann das Kontaminationsrisiko minimieren. Wir empfehlen eine monatliche Testung bzw. eine Überprüfung vor einer Kryo-Konservierung.

Wir überprüfen Zellkulturen für Sie

Nachgewiesen werden die Mykoplasmen über eine Polymerasekettenreaktion (PCR). Die verwendeten Primer erlauben der DNA-Polymerase die Vervielfältigung eines Abschnitts der 16S rRNA-Region des Mykoplasmengenoms. Amplifiziert wird ein PCR-Produkt mit einer Grösse von 268 bp. Dieses wird anschließend in einem Agarosegel sichtbar gemacht. Zu allen Proben werden parallel positive und negative Kontrollen mitgeführt. Das gewählte Template ist innerhalb der Gattung  Mycoplasma hochkonserviert, zeigt jedoch auch deutliche Sequenzhomologien zum Genom von verschiedenen Ureaplasmen. Eine Vielzahl der bekannten Mykoplasmen-Spezies werden gleichermaßen zuverlässig erkannt, jedoch ist eine Typisierung ist mit dieser Methode nicht möglich.

Detektionsgrenze

Die verwendete Nachweismethode ist hochsensitiv. Selbst bei einer sehr unwahrscheinlichen Reduzierung der Mykoplasmenzahl von bis zu 90% (z.B. durch Adhärenz), ist noch genügend Mykoplasmen-DNA im Zellkulturüberstand, um einen positiven Nachweis zu gewährleisten. Eine durchschnittliche kontaminierte Zellkultur enthält ca. 10⁶ Mycoplasmen/ml. Auch geringste Titer (5 Mykoplasmen pro Probenvolumen) sind mit unserer Methode sicher detektierbar.

Probenmaterial

• Zellkulturüberstand zur direkten Testung
• Testung nach DNA Extraktion:
  • Zellen
  • Gewebeextrakte
  • Kryokulturen
  • Seren
    

Probenvorbereitung

1. Entnehmen Sie bitte unter sterilen Bedingungen 500 µl Probe und füllen diese in ein steriles Eppendorf- Tube
2. Erhitzen Sie die Probe für mindestens 10 min bei 95 °
3. Das hitzeinaktivierte Probenmaterial ist nun für 2-3 Tage bei Raumtemperatur stabil

Eine Kultivierung ohne Antibiotika vor dem Test ist nicht unbedingt nötig, erhöht aber die Nachweissicherheit. Zellkulturen sollten bei fast vollständiger Konfluenz (>90%) überprüft werden. Bei sehr langen Dauerkulturen kann es zur Anreicherung von Inhibitoren der PCR im Kulturmedium kommen. In diesem Falle ist eine DNA Extraktion empfehlenswert.

Schicken Sie das Probenmaterial zusammen mit dem Auftragsformular an uns.

Anwendung

Die angebotene Dienstleistung ist ausschließlich für die Qualitätssicherung im Labor bestimmt. Sie ist nicht für die medizinische Diagnostik geeignet.

Wir bitten um Verständnis, dass wir Proben ab der Sicherheitsklasse 2 nicht mehr testen können. Für dieses Material ordern Sie bitte den von unserem Kooperationspartner Jena Bioscience vertriebenen Mykoplasmen-Kit.

Maßnahmen bei Kontaminationen

Positiv getestete Kulturen sollten verworfen werden, da eine vollständige Sanierung von kontaminierten Zellkulturen durch Antibiotikabehandlung kaum möglich erscheint. Mykoplasmen können in Zellen eindringen und sich damit einer Eliminierung entziehen. Später werden sie wieder freigesetzt und befallen die Zellen erneut.

Bestellung des Mycoplasmen-Detektions-Kits